J Exp Med：烟酰胺单核苷酸激酶（NNT）通过维持Fe-S蛋白功能而调节NSCLC线粒体代谢

人类前列腺癌发挥借助于强劲大而复杂的细胞内核葡萄糖，似乎是由脾组织的高硫性造成的。由于活性硫(ROS)的生成是这种葡萄糖的副衍生物，因此需以烟乙酰腺嘌呤二核苷硫酸羟基(NADPH)的形式来下降锌应激，以应对这种细胞内核活性的强劲化。烟乙酰单核苷硫酸转移酵素(NNT)可通过NADPH的生成来可维持细胞内核的抗锌技能，但其在非小细胞内前列腺癌(NSCLC)里面的功用尚未明确。本研究挖掘出NNT的表达出来在前列腺癌豚鼠建模里面相对来说强劲化了的形成和洪水泛滥性。另则有，促使研究挖掘出NNT纠正才会避免细胞内核外周，这与锌应激的大量增高无关，而是以铁硫亚基的活性下降为图案。这些局限性与NADPH的有效性和ROS的获益有关，这证明NNT在过重这些这两项亚基胺基硫酸的锌里面起着这两项功用。

实验设计

许多常见的前列腺癌豚鼠建模是能用C57BL6/J豚鼠的饲养策略而成立。奇怪的是，这些豚鼠携带纯合则有显子7-11的正上方纠正以及细胞内核里面Nnt基因序列的错义甲基化避免非功用亚基的表达出来。因此，可以能用这种连续性纠正的等位基因(NntΔex7-11)来评分NNT对前列腺癌频发的冲击。

首先，使用Kras甲基化(LSL-KrasG12D/+)造成的前列腺癌建模来检测Nnt表达出来对前列腺癌频发的冲击。携带Cre重组酵素的腺细菌感染LSL-KrasG12D/+豚鼠，可抑止KrasG12D在脾视网膜里面的表达出来和脾腺癌的形成。能用LSL-KrasG12D/+豚鼠和C57BL6/J豚鼠交配产生Nnt+/+表达出来豚鼠或NntΔex7-11/Δex7-11表达出来豚鼠(绘借助于1A-1B)。该建模里面Nnt的表达出来避免Cre重组酵素诱发的超重加快3个同月(绘借助于1C-1D)。然后，能用Kras甲基化与p53纠正同时表达出来(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也特指KP)成立前列腺癌建模。Nnt的表达出来从未改变Cre抑止的KP豚鼠的%-(绘借助于1E)。奇怪的是，在这个建模里面，p53的纠正消除了Nnt表达出来对前列腺癌形成的冲击，并且无论Nnt表达出来如何，实验就此都普遍存在相对来说的超重(绘借助于1F)。前列腺癌超重分之一的分析在相同甲基化豚鼠之间从未差异性(绘借助于1G-1H)。

虽然相同甲基化豚鼠之间的超重从未差异性，但似乎判读到建模里面洪水泛滥性的差异性。我们挖掘出Nnt+/+豚鼠里面51.3%的为3级(腺癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11豚鼠里面仅有36.5%和38.8%的是高级(绘借助于1I)。Nnt+/+豚鼠频发4级的频率相当大增高，证明了洪水泛滥性的变化(绘借助于1J)。总之，这些信息证明Nnt倡导了前列腺癌的频发和洪水泛滥。

2 NNT的纠正不冲击细胞内核里面硫硫还亚基(TXN)的抗锌体系

为了促使评量NNT对前列腺癌生物学的冲击，首先评量shRNA分心NNT亚基的表达出来，还包括4个表达出来NNT亚基的NSCLC细胞内系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不表达出来NNT亚基的H441细胞内(绘借助于2A)。分心NNT亚基表达出来抑制NSCLC细胞内的增殖技能(绘借助于2B)。并且挖掘出慢细菌感染4几天后NNT的缩水下降了H2009和PC9细胞内的生存技能(绘借助于2C)。此则有，H441细胞内的增殖免受NNT的冲击。

往往认为NNT有利于NADPH的催化技能，从而可维持细胞内核亚基抗锌该系统位处催化情况下(绘借助于2D)。分心NNT下降了H1299、H2009和PC9细胞内里面NADPH: NADP+的分之一 (绘借助于2E)。慢细菌感染4几天后细胞内核里面H2O2相当大增高(绘借助于2F)，所以NNT对H2O2药处理过程很最主要。

为了确定这些细胞内核ROS的增高是否是与细胞内核抗锌该系统有关，于是能用Western blotting评量细胞内核里面过锌物亚基3(PRDX3)的锌情况下。H2O2通过PRDX3药，即一对半胱氨硫酸二硫键抑止PRDX3形成丝氨硫酸，并且需要通过TXN催化这些半胱氨硫酸二硫键才能催化PRDX3的抗锌功用。PRDX3丝氨硫酸的获益是PRDX3锌的图案，是细胞内核锌应激的常用图案物。

奥拉诺芬是一种TXN催化酵素(TRXR)抑制剂，虽然奥拉诺芬的疗法才会避免PRDX3亚基大量锌，但NNT的纠正并从未增高PRDX3的锌(绘借助于2G)。此则有，NNT的纠正也从未下降细胞内核TXN2或TRXR2的亚基程度。总之，这些结果证明NNT在NSCLC细胞内增殖技能上发挥最主要功用，但NNT活性的丧失极为才会危害细胞内核TXN抗锌该系统，也不想造成相对来说的锌应激。

3 NNT的纠正才会危害细胞内核的锌技能

鉴于NNT在IMM里面的定位及其冲击膜上原子核数量级和催化技能，于是试绘借助于探讨NNT对细胞内核锌葡萄糖是否是最主要。首先，使用鲎细胞内则有数量级研究仪来进行细胞内核负荷测试，评量NNT纠正对一般细胞内核锌功用的冲击。结果挖掘出NNT纠正细胞内的耗硫量(OCR) 随细胞内核抑制剂的分作传递而被降低(绘借助于3A)。值得注意的是，NNT纠正细胞内的第二大气管技能在不依赖性于非谐振气管的才才会相当大下降(绘借助于3B)。这提示细胞内核锌局限性与NNT对原子核梯度的冲击无关。鉴于NNT纠正相对来说冲击气管技能，于是检测NNT纠正的H441细胞内是否是比NNT表达出来细胞内较强越来越少的锌和越来越强劲的糖酵解技能。这说明这些细胞内在从未NNT的才才会似乎通过细胞内核NADPH是从而可维持细胞内核的功用。

细胞内核的锌葡萄糖依赖性于ETC的功用，ETC由介导羟基化的Fe-S亚基亚基质组合成。毕竟Fe-S亚基亚基质的葡萄糖处理过程需NADPH，于是研究NNT分心后细胞内核气管功用的下降是否是与Fe-S亚基该系统性。细胞内核负荷测试可以对气管功用来进行一般性的研究，但不可以对单个ETC亚基质化学成分来进行评量。因此，作者来进行了极为专业课程的实验来研究Fe-S亚基依赖性的气管该系统性亚基质(I, II, III)。结果挖掘出，基于亚基质I(硫酸和苹果硫酸)的摄取，在NNT分心后亚基质I-III的活性相当大下降(绘借助于3C)。此则有，NNT局限性细胞内相对来说下降了钻石硫酸的OCR，证明下降了钻石硫酸脱氢酵素(SDH)活性和亚基质II-III容量(绘借助于3D)。避免这一自然现象的最主要原因是SDH在ETC和TCA可逆里面扮演着双重角色。

除了通过ETC可维持电子容量则有，Fe-S亚基还可维持对锌葡萄糖至关最主要的其他亚基酵素的功用。为了确定NNT是否是参与其他Fe-S亚基的功用，作者评量了TCA可逆里面Fe-S亚基——顺乌头硫酸酵素(ACO2)的活性。结果挖掘出分心NNT相当大下降了NSCLC细胞内系里面ACO2的活性(绘借助于3E)。ACO2活性的下降似乎才会毁坏TCA可逆，进而降低驱动ETC容量的催化性物质的生成。为了可用非小细胞内前列腺癌里面ACO2功用的研究，于是评分Nnt表达出来对KP前列腺癌里面ACO2活性的冲击。结果证明，Nnt+/+豚鼠里面Aco2活性相对来说高于NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11里面的，缺乏Nnt的发挥借助于最低的活性(绘借助于3F)。

4 则有源性NADPH在NNT纠正后可维持Fe-S亚基功用

为了确定与分心NNT该系统性的细胞内核Fe-S亚基功用的下降是否是与NADPH:NADP+的下降有关，我们试绘借助于发放一种细胞内核NADPH的则有源性是从。为了实现这一目标，我们可选择了蜂蜜细胞内核里面NADH激酵素pos5p，它可以羟基化NADH而产生NADPH。虽然pos5p以前在细菌里面也有则有源表达出来，但据我们所知，pos5p还从未被引入哺乳动物该系统。为了检测我们是否是能够有效地在人类NSCLC细胞内的细胞内核里面表达出来pos5p亚基，我们对蜂蜜亚基来进行了修饰，使其值得注意HA-tag。Western blot得借助于推论，在H1299、H2009和PC9细胞内的细胞内核里面出乎意料表达出来了HA-tag标记的pos5p亚基(绘借助于4A)。可选择这些细胞内系是为了评量pos5p修复和NNT纠正该系统性的Fe-S亚基局限性的技能，挖掘出分心NNT后对它们造成很严重的冲击。

pos5p的表达出来挽救了细胞内里面分心NNT后造成的NADPH: NADP+分之一的降低(绘借助于4B)。这与表达出来pos5p细胞内里面pos5p扰后气管核硫酸复杂活动的降低有关(绘借助于4C和4D)。此则有，pos5p的表达出来实质上挽救了NNT分心后ACO2活性的下降(绘借助于4E)。总之，这些信息证明可维持NNT表达出来纠正时NADPH的程度可以保护NSCLC细胞内里面Fe-S亚基的功用。

5 NNT的纠正不想毁坏Fe-S亚基的葡萄糖

毕竟细胞内核则有源性NADPH能够西移动NNT纠正该系统性Fe-S亚基的局限性，并且NADPH是高效可维持Fe-S亚基葡萄糖的必备条件，因此我们接下来试绘借助于确定NNT活性是否是可维持这一处理过程。Fe-S亚基葡萄糖频发在一个由半胱氨硫酸副产物酵素(NFS1)和Fe-S支架亚基(ISCU)组合成的多亚基亚基质里面。亚基质里面任何一种化学成分的纠正都才会冲击葡萄糖，并且也与细胞内核局限性该系统性。因此，我们分心NFS1或ISCU表达出来来研究毁坏Fe-S亚基葡萄糖后对气管核硫酸和ACO2的冲击。

在H2009细胞内里面，分心NFS1后相当大下降硫酸/苹果硫酸加成和钻石硫酸加成里面气管核硫酸亚基质I-III的活性，而在PC9细胞内里面只有亚基质II-III活性被相对来说下降(绘借助于5A和5B)。另则有，两个细胞内系里面，在硫酸/苹果硫酸和钻石硫酸的功用下，分心ISCU表达出来后相当大西移动了OCR(绘借助于5A和5B)。并且分心NFS1或ISCU后相当大下降了细胞内系里面ACO2活性(绘借助于5C)。奇怪的是，NNT分心后所造成的局限性与Fe-S亚基葡萄糖所需物质造成的局限性是同等最主要的(绘借助于5A-5C)。

为了证明Fe-S亚基局限性对NSCLC细胞内的细胞内核葡萄糖有功用性冲击，我们对分心NNT或ISCU细胞内来进行基于毛细管色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的葡萄糖组学研究。 对这些细胞内TCA可逆的葡萄糖物来进行研究，得借助于推论大多数里面间衍生物的丰度频发了相当大变化(绘借助于5D)。这些都证明了锌葡萄糖的严重毁坏和Fe-S亚基功用局限性的连续性。具体地说就是分心NNT和ISCU表达出来后，硫酸、苹果硫酸和富马硫酸被消耗掉。NNT纠正细胞内里面的柠檬硫酸程度被耗尽，但分心ISCU细胞内里面并从未此结果。另则有，分心ISCU细胞内里面钻石硫酸大量获益，而在NNT纠正细胞内里面则不普遍存在此自然现象(绘借助于5D)。

除了Fe-S亚基ACO2和SDH则有，TCA可逆还依赖性于另一种细胞内核Fe-S亚基——FAD硫酸催化酵素(LIAS)的功用。LIAS对于FAD硫酸的催化以及最主要FAD硫酸矿羧基的阴离子都极为这两项，FAD硫酸矿羧基由PDH (E2)和α-酮戊二硫酸脱氢酵素(二氢FAD乙酰S-钻石酰转移酵素，DLST)组合成。LIAS对Fe-S亚基葡萄糖的毁坏特别恰当，因为其Fe-S簇在催化处理过程里面被消耗掉掉，这就要求不断地来进行亚基绑定。事实上，分心NFS1和ISCU表达出来才会大量降低PC9细胞内里面PDH-E2和DLST的脂化，然而分心NNT对亚基脂化无冲击(绘借助于5E)。总的来说，这些信息证明，NNT造成了酵素和葡萄糖局限性，它们的局限性与Fe-S亚基葡萄糖的毁坏该系统性，但NNT不似乎直接冲击这一处理过程。这反映借助于分心NNT和ISCU后对TCA可逆产生相近但又相同的冲击。

6 NNT的纠正毁坏葡萄糖葡萄糖

除了消耗掉TCA可逆则有，NNT局限性细胞内的LC-HRMS葡萄糖组学研究证明葡萄糖葡萄糖失调。分心NNT倡导长核硫酸碳水化合物烷基谷氨硫酸的大量获益，而长核硫酸碳水化合物烷基谷氨硫酸是葡萄糖β-锌的底物(绘借助于6A)。鉴于在NNT局限性细胞内里面普遍存在气管该系统局限性，我们推测这些烷基谷氨硫酸的增高是由于葡萄糖锌降低。我们挖掘出在H1299和PC9细胞内里面OCR与仙人掌硫酸矿的锌有关，分心NNT后OCR下降(绘借助于6B)。我们还判读到NNT局限性细胞内里面饱和葡萄糖和不饱和葡萄糖均大量获益(绘借助于6C)。葡萄糖催化需消耗掉大量NADPH，而且NNT分心后NADPH的有效性下降，于是我们认为这些葡萄糖程度的增高是由于则有源性葡萄糖摄入的增高。另则有，我们挖掘出，NNT局限性细胞内强劲化了对荧光仙人掌硫酸相近物的吸收技能(绘借助于6D)。为了评分NNT分心后葡萄糖的获益是否是是一个潜在的不利因素，我们使用饱和葡萄糖仙人掌硫酸酯刺激NNT局限性细胞内24小时，挖掘出NNT分心后使H1299和H2009细胞内对仙人掌硫酸矿恰当(绘借助于6E)。此则有，NNT分心后相当大增高了H1299和PC9细胞内对也就是说不饱和葡萄糖油硫酸矿的恰当性(绘借助于6F)。鉴于则有源性葡萄糖可用的有害冲击，我们预计细胞内则有人体内消耗掉将保护NNT的纠正。令人惊讶的是，培养基里面的人体内消耗掉日益严重了NNT的缩水(绘借助于6G)。越来越最主要的是，NNT分心后细胞内则有人体内缺少才会增高NADPH的消耗掉(绘借助于6H)，这证明在缺乏则有源性葡萄糖的才才会被迫催化葡萄糖，使NNT局限性细胞内里面NADPH的有效性下降。总的来说，这些信息证明NNT似乎在调节葡萄糖葡萄糖里面起最主要功用，NSCLC细胞内的葡萄糖葡萄糖紊乱似乎是一个可能用的弱点。

7 NNT纠正后细胞内核抑制剂过锌氢酵素(MitoCatalase)挽救Fe-S亚基功用

Fe-S亚基对分子硫和越来越多有害物质的锌极为恰当。虽然我们从未判读到细胞内核亚基抗锌该系统的锌情况下频发变化，但这极为回避NNT分心后造成了的细胞内核ROS越来越多将这些恰当性胺基硫酸锌。为了探究这种似乎性，我们使用了细胞内核抑制剂的过锌氢酵素(MitoCatalase)来强劲化细胞内核的抗锌技能。我们出乎意料地在H1299、H2009和PC9细胞内里面过表达出来了MitoCatalase (绘借助于7A)。MitoCatalase的表达出来也部分西移动了NNT分心后该系统性细胞内核里面H2O2的产生(绘借助于7B)。这与NNT分心后气管核硫酸复杂活动的降低相比较应(绘借助于7C和7D)。另则有，MitoCatalase的表达出来恢复NNT分心后ACO2的活性(绘借助于7E)。综上所述，这些信息证明，增高细胞内核药H2O2的技能可以避免NNT分心后Fe-S亚基频发局限性，从而使NNT在避免Fe-S亚基频发锌方面发挥功用，但对Fe-S簇的葡萄糖无功用。

推论

总之，我们的研究证明，NNT对前列腺癌生物学较强最主要意义，主要是通过催化反应Fe-S亚基而倡导细胞内核葡萄糖。与以往评分NNT功用的研究相同，我们描述了NNT对NSCLC里面细胞内核锌催化周期性的错综复杂冲击。在NSCLC里面，NNT活性似乎过重了大量锌葡萄糖造成的锌应激加成。我们的挖掘出促使证明了细胞内核葡萄糖在前列腺癌频发里面的合理性，说明细胞内核功用的强劲化似乎是前列腺癌疗法的一个最主要靶点。酵素TPH-1对胃保护起这两项功用，似乎作为疗法CKD的潜在疗法靶点。

原始借助于处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.